Hoje, vamos falar sobre o problema que causou inúmeros colegas de pesquisa - o experimento Western Blot (WB). Esse experimento aparentemente simples, mas cheio de "armadilhas", por que sempre nos faz tropeçar de novo e de novo? Agora vamos revisar os motivos de falhas juntos.
I. Sem bandas
Os motivos possíveis podem incluir:
- Questões de anticorpos: o anticorpo pode ser ineficaz, inespecífico ou não se ligando à proteína alvo.
- Problemas de amostra: a amostra pode conter substâncias interferentes, ter muito baixa concentração ou já se degradou.
- Problemas de eletroforese: condições inadequadas de eletroforese, como tensão, tempo ou uso inadequado de buffer.
- Problemas de transferência: problemas durante o processo de transferência, como seleção inadequada de membrana, tempo de transferência ou buffer de transferência.
- Problemas de bloqueio: a solução de bloqueio pode ser inadequada ou o tempo de bloqueio pode ser muito longo.
- Problemas de coloração: o reagente de coloração pode ser expirado, insensível ou usado indevidamente.
Problemas do equipamento: o equipamento pode funcionar mal ou não ser devidamente calibrado.
- Problemas de operação experimental: A operação experimental não pode ser padronizada, como lavagem insuficiente ou carregamento desigual de amostras.
- Questões de modificação de proteínas: A proteína alvo pode sofrer modificações pós-traducionais que impedem o reconhecimento de anticorpos.
- Problemas de expressão de proteína alvo: a proteína alvo pode ter expressão muito baixa ou nenhuma expressão nas células ou tecidos sendo detectados.
Ii. Antecedente alto
Os motivos possíveis podem incluir:
- Alta concentração de anticorpos: o uso de muito anticorpo pode aumentar a ligação inespecífica, resultando em um fundo alto.
- Questões de qualidade do anticorpo: o anticorpo pode ter alta ligação inespecífica ou reação cruzada com outras proteínas.
- Bloqueio insuficiente: a solução de bloqueio falha em cobrir efetivamente locais de ligação inespecífica na membrana, resultando em um fundo alto.
- Questões de membrana: a membrana pode ter baixa qualidade ou contaminação, levando a um fundo alto.
- Transferência incompleta: Durante o processo de transferência, as proteínas não podem ser totalmente transferidas para a membrana, resultando em um fundo alto.
- Lavagem insuficiente: as etapas de lavagem não removem efetivamente o anticorpo não ligado ou outras impurezas, levando a um fundo alto.
- Problemas de reagente de coloração: o reagente de coloração pode ser muito sensível ou instável, resultando em alto plano de fundo.
- Questões experimentais do equipamento: o equipamento pode ter vazamento ou interferência, levando a um fundo alto.
- Problemas da amostra de proteínas: A amostra pode conter uma grande quantidade de substâncias interferentes, como produtos de degradação de proteínas ou outras impurezas.
- Problemas de operação experimental: A operação experimental não pode ser padronizada, como tempo prolongado de incubação ou alta temperatura.
Iii. Bandas inespecíficas ou tamanhos de bandas de proteínas incorretas
Os motivos possíveis podem incluir:
- Muitas passagens de células, resultando em diferentes níveis de expressão de proteínas, levando a tamanhos de bandas inconsistentes ou a presença de várias bandas.
- Degradação da amostra de proteínas, resultando em menor peso molecular da proteína ou na presença de várias bandas.
- As amostras de proteínas expressas in vivo podem ter várias formas de modificações, como acetilação, metilação, alquilação, fosforilação e glicosilação, levando a tamanhos de bandas inconsistentes ou a presença de várias bandas.
- A proteína alvo contém múltiplas isoformas ou variantes de emenda, resultando em tamanhos de banda inconsistentes ou na presença de várias bandas.
